【摘要】  目的探讨丹红注射液(Danhong injection)对睡眠剥夺(sleep deprivation, SD)大鼠学习记忆及海马胶质纤维酸性蛋白(Glial Fibriliary Acidic Protein，GFAP)表达的影响。方法用小平台水环境法建立SD模型。选用Wistar大鼠，根据SD时间的不同(0～5 d)，随机分为6组，每组又分为实验组和对照组，实验组给予丹红注射液，相应时间点对各组大鼠行Morris水迷宫测试，免疫组化法检测海马组织中GFAP的含量。　　结果①Morris水迷宫实验： 2，3，5 d组潜伏期，实验组低于对照组(P<0.05)，4 d组潜伏期，实验组低于对照组(P<0.01);2 ，5 d组游泳路程，实验组低于对照组(P<0.05)，3，4 d组游泳路程，实验组低于对照组(P<0.01);SD各时间点组穿越平台次数，实验组和对照组无统计学差异(P>0.05)。②海马GFAP含量：2 ，3 d组海马GFAP含量，实验组高于对照组(P<0.05)，4，5 d组海马GFAP含量，实验组高于对照组(P<0.01)。结论丹红注射液对SD后大鼠学习记忆的损害有保护作用，这种作用可能与海马中星形胶质细胞(astrocyte，AS)功能活化有关。

【关键词】  丹红注射液;睡眠剥夺;学习记忆;胶质纤维酸性蛋白;Morris水迷宫

　Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of Danhong injection on cognitive function and the content of glial fibriliary acidic protein (GFAP) in hippocampus of Wistar rats during Sleep Deprivation(SD).MethodsSD was induced in Wistar rats by employing "flower pot" technique. The 72 rats were randomly divided into six groups according to the time of SD(0-5 d), and every group was also divided into two subgroups: experimental group and control group. The behaviors of rats were studied in Morris maze test at given time. Then immunohistochemistry was used to detect the level of GFAP in hippocampus.　　ResultsCompared with control groups, the escape latency and swimming distouce of experimental groups induced in 2,3,4,5 d(P<0.05) were decreased.There was no obvious difference in the times across plot between the experimental groups and control groups (P>0.05). Compared with control groups, the content of GFAP of experimental groups was increased on 2,3,4,5 d (P<0.05).ConclusionDanhong injection can improve the rat impairment of cognitive function induced by SD via the activation of astrocyt(AS) in hippocampus.

　　Key words： Danhong injection; Sleep deprivation; Cognitive function; Glial fibriliary acidic protein; Morris water maze

　　睡眠剥夺(sleep deprivation, SD) 是一种特殊的生理心理状态，可引起机体认知功能、情绪、行为及免疫功能等一系列改变[1]。既往有研究表明[2]，SD可影响动物的学习记忆能力。在战争环境下或特殊职业里，SD是不可避免的。因此，为了保证作业人员的安全与健康，保证作战和特殊职业工作的需要，探讨减少SD对机体影响的措施具有十分重要的意义。我们着眼于中药领域，采用动物行为学的方法，试图去了解丹红注射液(Danhong injection)对SD的对抗作用，并检测海马中胶质纤维酸性蛋白(Glial Fibriliary Acidic Protein，GFAP)的表达规律，以期阐明其可能机制。高级职称论文发表

　　1材料和方法

　　1.1动物及分组成年、健康Wistar大鼠，雌雄各半，体质量200～220 g，由甘肃省中医学院实验中心提供[合格号：SCXK(甘)2004-2006]。对连续3次120 s内未找到隐匿平台的的大鼠予以删除。根据SD时间的不同，72只大鼠随机分为正常睡眠(NS)、睡眠剥夺1，2，3，4，5 d等 6组;每组又分为实验组和对照组，每组6只。实验组以丹红注射液(菏泽步长制药有限公司惠赠)7.2 ml/kg腹腔注射给药，1次/d，连续7 d，对照组以同样方式给予等量生理盐水。

　　1.2睡眠剥夺模型的建立采用小平台水环境法(flower pot)建立大鼠SD模型。参照文献[3]制作大小为30 cm×30 cm×30 cm的鼠箱，中央放一直径为6.5 cm，高8 cm的平台。箱内注有水，水面低于平台2 cm，水温保持在20 ℃左右。大鼠可以在平台上自由摄取食物和水，但当进入快速眼动睡眠(rapid eye movement sleep, REM)时，由于骨骼肌的松弛使大鼠掉入水中而惊醒，如此反复多次造成REM的剥夺。在大鼠活动空间内给予12 h/12 h明暗交替，室内温度控制在18~22 ℃。

　　1.3水迷宫组成Morris水迷宫由北京硕林苑公司生产。包括一直径150 cm、高60 cm的圆形不锈钢水池，内壁黑色，置有直径15 cm、高25 cm的透明有机玻璃平台，以及水迷宫测试系统。实验时，平台隐藏在水下2 cm，水温保持在(22±0.5)℃。池壁上标有东南西北4个入水点，它们将水池划分为4个象限，在任意一象限区中间放置平台，平台没于水下2 cm。水池周围围有窗帘尽量消除外界影响，池壁水面上贴有不同颜色不同形状纸片。在实验过程中，保持环境安静。

　　1.4行为实验实验分为定位航行试验和空间探索试验两个部分。

　　1.4.1定位航行实验(place navigation test，PNT)每天08：00~11：00之间对每只大鼠进行训练，不选平台所在象限作为入水点，按顺时针方向把大鼠面向池壁放入水中，检测大鼠隐匿平台潜伏期。如果在规定的最长时间120 s内未到达平台，则由实验者将其引至平台，逃避潜伏期记为120 s，大鼠在平台休息20 s后进行下1次测试。观察并记录动物找到并爬上平台的潜伏期、游泳路程及游泳轨迹。3 d训练结束后将大鼠按组别放入睡眠剥夺箱。SD时间点到后进行最后1次PNT，记录平均潜伏期、平均游泳路程作为该只大鼠所得成绩。

　　1.4.2空间探索实验 (spatial probe test，SPT)各组大鼠最后1次PNT后撤除平台，将大鼠从最后1次入水点面向池壁放入水中，使大鼠在水迷宫中连续游泳，记录大鼠120 s内穿越原平台平面的次数。

　　1.5海马GFAP的测定各组大鼠最后1次水迷宫测试完后，在10%水合氯醛麻醉下用0.9%生理盐水200 ml经心脏快速灌注冲洗，再用4%多聚甲醛(用0.1 MPB配制，pH7.2~4.4)200 ml灌注取脑后固定。包埋，定位海马，冠状面切片，片厚3 μm;抗原热修复后依次加入3% H2O2、10%山羊血清封闭液，各在37 ℃温箱孵育10 min，加入1∶100 GFAP抗体，于4 ℃冰箱过夜，滴加二抗工作液及辣根酶，DAB显色，光镜下观察胞质呈棕黄色为阳性细胞。对照组染色步骤相同，阴性对照用PBS代替一抗。

　　1.6数据处理切片在统一放大倍数(10×40)下随机选5个视野，输入图像分析系统，以光密度值(Optical density)表示GFAP的含量，计算其均值。实验数据均采用SPSS16.0软件进行统计，进行单因素方差分析和组间t检验。

　　2结果

　　2.1睡眠剥夺大鼠Morris水迷宫测试各组大鼠SD后Morris水迷宫测试游泳潜伏期及路程均延长，实验组和对照组不同SD时间之间有统计学差异(P<0.01)，穿越平台次数下降不明显(P>0.05)。与对照组相比，实验组2，3 d及5 d组潜伏期缩短(P<0.05)，4 d组潜伏期缩短(P<0.01);实验组2 d及5 d组游泳路程缩短(P<0.05)，3 d及4 d组游泳路程缩短(P<0.01);实验组及对照组之间，穿越平台次数无明显变化(P>0.05)，差异无统计学意义(表1～3及图1~3)。表1睡眠剥夺大鼠Morris水迷宫测试潜伏期比较图1睡眠剥夺大鼠Morris水迷宫测试潜伏期比较表2睡眠剥夺大鼠Morris水迷宫测试路程比较高级职称论文发表

　　2.2睡眠剥夺大鼠海马组织GFAP的检测各组大鼠SD后海马中GFAP含量均增高，实验组和对照组不同SD时间之间有统计学差异(P<0.01)，形态学上表现为海马区GFAP阳性细胞增多，胞体变大，突起增粗增长。与对照组相比，实验组2 d及3 d组GFAP含量增高(P<0.05)，4 d及5 d组GFAP含量增高(P<0.01)，实验组和对照组之间有统计学差异(表4及图4)。
　3讨论

　　小平台水环境法(“flower pot” technique)是研究SD的常用方法，该方法主要剥夺大鼠的REM睡眠。既往研究[4]认为REM睡眠对学习记忆的获得有重要意义，REM睡眠剥夺影响学习记忆能力。丹红注射液是中药丹参和红花的复方制剂，其主要成分有丹参酮、丹参酚酸及红花黄素等, 有改善微循环、抗氧化损伤、脑损伤保护作用[5]。由于中药起效慢，作用时间长，研究认为一般用药时间至少3~7 d。因此，本实验选择7.2 ml/kg为给药剂量，给药1次/d，连续给药7 d，给药完毕即进行SD。图2睡眠剥夺大鼠Morris水迷宫测试游泳距离比较图3睡眠剥夺大鼠Morris水迷宫测试穿越平台次数比较图4睡眠剥夺大鼠海马GFAP含量光密度值比较本研究使用的Morris水迷宫中，PNT主要考察大鼠的空间分辨学习能力，SPT主要测量大鼠的记忆保持能力、工作记忆。研究结果表明，大鼠经过SD后，其学习记忆能力受影响，表现为PNT潜伏期延长、游泳路程增加，但SPT穿越平台次数则无明显差别，说明REM期SD对大鼠在Morris水迷宫中的空间分辨性学习记忆能力产生明显损害，而对非空间学习、工作记忆则无明显影响。短时间SD(1 d)对大鼠学习记忆能力影响不大，随着SD时间的延长，其影响程度逐渐增加，尤其是4 d以后，潜伏期明显延长，游泳路程明显增加。表3睡眠剥夺大鼠Morris水迷宫测试穿越平台次数比较表4睡眠剥夺大鼠海马GFAP含量光密度值比较给大鼠腹腔注射丹红注射液在一定程度上能改善SD造成的学习记忆功能下降，使其游泳潜伏期和游泳路程缩短。这种保护作用在短时间SD(1 d)下表现不明显，随SD时间的延长逐渐增强，以3~4 d最为明显，这可能与中药起效慢、作用缓和、作用时间持久有关。随SD时间延长至5 d时，尽管实验组和对照组比较，差异仍有统计学意义，但两组的游泳潜伏期及游泳距离均延长至SD前的2倍左右，学习记忆能力已严重受损。由此看来，丹红注射液对睡眠剥夺大鼠学习记忆功能的保护作用有一定时限性，似乎以3~4 d效果较好。研究也显示，丹红注射液对正常大鼠(NS组)的学习记忆促进作用不明显。SPT中，与对照组相比，实验组各时间点的穿越平台次数略有增加，但差异无统计学意义，考虑这种增高可能是因为丹红注射液使大鼠的兴奋性增强，提高了其自发活动和探究行为。

　　星形胶质细胞(astrocyte，AS)占中枢神经细胞总数的40%~60%，而GFAP已成为AS活化的特异性标志。研究发现，AS不仅仅对神经元起支持填充作用，而且可以通过神经递质的释放与神经元进行对话，调节神经元功能，并在突触形成和突触可塑性中起重要作用[6, 7]。结果显示，大鼠经过SD后，实验组及对照组海马区内GFAP的表达均增强，且随着SD时间的延长逐渐增强，以5 d时最为明显。与对照组相比，实验组GFAP的表达明显增强。这种增强在短时间(1 d)SD下并不明显，SD 2 d后差异逐渐增大，并在3~4 d达到高峰。此外，我们还观察到，丹红注射液对学习记忆及GFAP表达的影响均在SD 2 d后开始明显，3~4 d达到高峰，这似乎在提醒我们丹红注射液对学习记忆功能的保护作用可能是通过海马中AS的活化实现的。丹红注射液的药理作用包括：①扩张血管，改善微循环;②通过抑制血小板聚集，防止血小板过度激活，起到抗凝及溶解血栓作用;③保护血管内皮;④促进血管再生;⑤防止兴奋性氨基酸对神经元的损伤。丹红注射液可能通过抑制神经元凋亡对神经元的损伤起到保护作用，其具体的保护机制可能与抑制NMDA受体兴奋后引发的钙超载或阻止Caspase的活化等有关[8]。有报道丹参酚酸可减轻大鼠脑水肿，改善大鼠的运动、记忆功能[9]，减轻感觉运动中枢及海马CA1区神经细胞损伤，并促进海马神经元的神经发生[10]。中药的具体药理作用机制较复杂，丹红注射液如何影响AS的活化、通过什么机制影响神经元功能，这可能是下一步研究需要探讨的问题。

【参考文献】
  　[1]Datta S, Mavanji V, Ulloor J, et al. Activation of phasic pontine-wave generator prevents rapid eye movement sleep deprivation-induced learning impairment in the rat: a mechanism for sleep-dependent plasticity[J]. J Neurosci,2004,24(6):1416.

　　[2]刘国龙, 赵明亮, 万子兵, 等. 睡眠剥夺对大鼠空间学习记忆的影响及其LTP机制的研究[J]. 第三军医大学学报,2006,28(6):569.

　　[3]Youngblood B D, Zhou J, Smagin G N, et al. Sleep deprivation by the "flower pot" technique and spatial reference memory.[J]. Physiol Behav,1997,61(2):249.

　　[4]李训军, 严家川, 潘峰, 等. REM睡眠剥夺对大鼠额叶皮质5-TH的含量及学习记忆的影响[J]. 重庆医学,2009,38(10):1151.

　　[5]邓芬, 胡长林, 谢运兰. 丹红注射液治疗大鼠急性脑梗死的实验研究[J]. 中西医结合心脑血管病杂志,2007,5(5):421.

　　[6]Hu R, Cai W Q, Wu X G, et al. Astrocyte-derived estrogen enhances synapse formation and synaptic transmission between cultured neonatal rat cortical neurons.[J]. Neuroscience,2007,144(4):1229.高级职称论文发表

　　[7]Wu J, Holstein J D, Upadhyay G, et al. Purinergic receptor-stimulated IP3-mediated Ca2+ release enhances neuroprotection by increasing astrocyte mitochondrial metabolism during aging.[J]. J Neurosci,2007,27(24):6510.

　　[8]吴旭青, 丁晶, 范薇. 丹红注射液对体外神经元N-甲基-D-天冬氨酸损伤后的保护作用[J]. 中国临床医学,2009,16(4):609.

　　[9]Du Gh, Qiu Y, Zhang J T. Salvianolic acid B protects the memory functions against transient cerebral ischemia in mice.[J]. J Asian Nat Prod Res,2000,2(2):145.

　　[10]Tang M, Feng W, Zhang Y, et al. Salvianolic acid B improves motor function after cerebral ischemia in rats.[J]. Behav Pharmacol,2006,17(5-6):493.