【摘要】  目的对疏毛吴茱萸Evodia ruatecarpa(Juss.) Bneht.var.bodinieri(Dode) Huang挥发性成分进行分析，研究萃取纤维的选择、萃取时间、萃取温度以及解吸时间等对疏毛吴茱萸挥发性成分萃取的影响，优化提取条件。方法利用顶空固相微萃取和气相色谱-质谱联用技术(HS-SPME-GC-MS)。结果分离出85个化合物，其中鉴定了77个化合物，主要是月桂烯(3.70%)、反式-罗勒烯(1.71%)、顺式-罗勒烯(14.47%)、β-榄香烯(9.79%)，石竹烯(9.46%)、大根香叶烯(19.77%)、α-布藜烯(3.37%)、α-金合欢烯(7.31%)、γ-榄香烯(2.00%)、环十二烷己酮(2.68%);优化条件是：PDMS 100 μm,提取温度60℃，萃取时间 30min,解吸时间5 min。结论确定顶空固相微萃取GC-MS分析疏毛吴茱萸的分析方法。

【关键词】  顶空固相微萃取;气-质联用仪;疏毛吴茱萸;挥发性成分

　Abstract:ObjectiveTo analyze the volatile phytochemical compositions of fruits from Evodia ruatecarpa(Juss) Bneht.var.bodinieri(Dode) Huang and to investigate the effects of extraction fibre,extraction time,extraction temperature and desorption time on the HS-SPME of the volatile phytochemical compositions.MethodsHeadspace solid-phase micro-extraction(HS-SPME) coupled to capillary gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS) was adopted.Results85 compound were separated and 77 of them were identified.The major components were myrcene(3.70%),1,3,6-octatriene,3,7-dimethyl-,(E)(1.71%),1,3,6-octatriene,3,7-dimethyl-,(Z)(14.47%),β-elemene(9.79%)，carophyllene(9.46%),germacrene D(19.77%),α-bulnesene(3.37%),α-farnesene(7.31%),γ-elemene(2.00%),and 1-cycoldodecylethanone(2.68%).The optimal conditions were as follows:extracted fibre PDMS 100μm,extracted temperature 60℃,extracted time 30 min,desorbed time 5 min.ConclusionThe GC-MS method of E.ruatecarpa extracted by HS-SPME was established.

　　Key words:Headspace solid-phase micro-extractions(HS-SPME);GC-MS;Evodia ruatecarpa(Juss.) Bneht.var.bodinieri(Dode)Huang;Volatile phytochemical component

　　疏毛吴茱萸Evodia ruatecarpa(Juss.)Bneht.var.bodinieri(Dode)Huang 属芸香科植物，其干燥近成熟果实是中药吴茱萸的主要源生药之一[1]，为常用中药材，也是贵州地区常用苗族用药，别名米辣子、臭辣子树、气辣子、豆卡欧等。吴茱萸辛、苦，热;有小毒，其药物功效在《神农本草经》《名医别录》《本草拾遗》和《本草纲目》等中医古典医籍中均有详尽记载。吴茱萸临床应用较广，现代研究证实了其所含化学成分种类的多样性。中医认为其具有散寒止痛、疏肝下气、温中燥湿等功效，用于治疗脘腹冷痛，厥阴头痛，疝气肿痛，痛经，呕吐吞酸，寒湿泄泻等[2,3]。药理研究表明，吴茱萸具有减肥[4]、支气管收缩[5]，刺激牛肾上腺髓质儿茶酚胺的分泌，抑制雄性大鼠带状血管球细胞释放醛固酮[6]，减少大鼠睾丸间质细胞睾酮的分泌，体外实验抑制鼠克隆癌细胞肺转移[7]、对K通道有阻滞[8]等作用。疏毛吴茱萸的挥发油部分是其药用的有效成分之一，有降低乙酰胆碱的功能，抑制麦角胺对α-受体的阻断作用[9]。疏毛吴茱萸中挥发性物质的提取技术主要有：液-液萃取(LLE)、静态顶空法(SHP)、动态顶空法(DHP)、蒸馏萃取(SDE)、超临界流体萃取法(SCFE)等，这些方法各有利弊，都存在一些缺陷，如：液-液萃取的有机溶剂是有毒性的，污染环境，需要样品量大且会引起某些化学结构或组分的变化;静态顶空法主要缺点是样品的蒸气体积过大，影响色谱柱的分离效能;蒸馏萃取一般需要花费几个小时，能耗较大而且有些易挥发性物质逸出是难免的。固相微萃取(SPME)是一种全新概念的样品预处理浓缩技术，它克服了传统提取方法的缺陷，与其它技术相比，具有简便、灵敏度高、重复性及线性好、样品处理时间短、分析样品用量少、无需有机溶剂和绿色环保等优点[10]。虽然疏毛吴茱萸为较常用的传统中药，但目前国内外对疏毛吴茱萸中挥发性物质研究报道甚少。虽对其挥发油成分也有少量研究报道[11]，其都是用传统的水提法，但顶空固相微萃取(HS-SPME)法提取其挥发油的报道还没有查阅到。为了更好地了解疏毛吴茱萸挥发性成分，本文采用HS-SPME萃取法提取疏毛吴茱萸中的挥发性成分，用气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析法，结合质谱NIST数据库检索以及相关文献对化合物进行分离鉴定，为疏毛吴茱萸的进一步开发提供理论依据。论文发表核心期刊

　　1器材

　　1.1材料疏毛吴茱萸采自贵州省余庆县，经贵阳中医学院生药实验室王世清教授鉴定为Evodia ruatecarpa (Juss.)Bneht.var.bodinieri(Dode)Huang 的干燥未成熟果实。

　　1.2仪器气质联用仪，GCMS-QP2010(日本岛津公司)，顶空固相微萃取HS-SPME 装置(美国Supelco 公司);PDMS 100 μm，PDMS 75 μm，PDMS 7 μm 纤维萃取头(美国Supelco公司);5 ml顶空瓶。

　　2方法

　　2.1 HS-SPME萃取疏毛吴茱萸挥发性化学成分的萃取：在5 ml装有磁力搅拌器的顶空瓶中加入0.5 g的疏毛吴茱萸待测样品，分别在不同纤维的萃取头、萃取温度、萃取时间及GC解吸时间为5 min，进行GC-MS分析。

　　2.2气相色谱条件GC条件：HP-5弹性石英毛细管色谱柱(30 m× 0.25 mm×0.25 μm);升温程序：初始温度40℃保持3 min，以5℃/min升至100℃，保持1 min，以3℃/min升至160℃，以6℃/min升至220℃，保持16 min。载气：氦气;载气流速：0.76 ml/min;进样口温度：250℃。

　　2.3质谱条件离子源为：EI;电离电压：70 eV;离子源温度：230℃;溶剂延迟时间：2 min;质谱范围：40~400;扫描周期：0.5 scan/s;分析结果运用质谱数据库NIST147标准谱库进行检索。

　　2.4定性、定量方法质谱结果经计算机检索(质谱数据库NIST147)以及相关的文献进行定性分析。利用面积归一法计算已定性出的挥发性成分的相对含量。

　　3 结果

　　3.1SPME萃取效果的正交实验和单因素实验选择具有代表性的疏毛吴茱萸挥发性成分月桂烯、E-罗勒烯、Z-罗勒烯、β-榄香烯、石竹烯、大根香叶烯D、α-布藜烯、α-金合欢烯、γ-榄香烯和环十二烷己酮等10种芳香物在GC-MS的TIC图谱中的峰面积大小为指标，对该方法萃取疏毛吴茱萸挥发性化学成分的条件进行优化。

　　3.1.1正交实验优化SPME法提取条件从材料学、热力学和动力学分析可知，固相微萃取吸附效率的影响因素主要包括萃取头类型、萃取温度和萃取时间。以此三者作为考察因素，并结合预试验情况，选取4因素3水平进行L9(34)正交表安排试验，以上述10 种化学成分在GC-MS的TIC图谱中的峰面积大小为指标，优选最佳工艺，为了提高统计分析的可靠性，每一条件下都作了重复试验 (n=3)，测定结果取其平均值供统计分析用。因素水平见表1。表1正交实验因素水平疏毛吴茱萸目标挥发性成分测定：依据表2设计9 组试验，按照“2.4”方法, 我们以疏毛吴茱萸中挥发性化学成分中含量较大的10 种有效成分作为特征值，分别计算出每组中月桂烯、反式-罗勒烯、顺式-罗勒烯、β-榄香烯、石竹烯、大根香叶烯D、α-布藜烯、α-金合欢烯、γ-榄香烯、环十二烷己酮等10 种芳香物在GC-MS的TIC图谱中的总峰面积。结果见表2。表2HS-SPME萃取正交实验结果SPME提取正交实验结果：HS-SPME提取正交实验中各因素和水平之间的16种组合方式及每组试验的结果见表2，方差分析结果见表3。表3HS-SPME萃取正交实验 方差分析从表2~3结果可见，HS-SPME萃取疏毛吴茱萸挥发性化学成分的影响因素中纤维萃取头类型的影响最显著，萃取时间次之，萃取温度的影响最不显著。由此得到HS-SPME萃取疏毛吴茱萸挥发性化学成分的最佳工艺方法是A3B2C2，即采用PDMS 100 μm萃取头，在60℃温度下，萃取30 min。
　3.1.2疏毛吴茱萸挥发性成分测定的单因素实验对于HS-SPME-GC-MS分析样品来说，在同一温度下，待测组分解吸完全程度与解吸时间直接相关。解吸不完全不仅会影响方法的灵敏度，而且会污染后续样品，但长时间高温解吸会缩短萃取纤维的寿命。而在一定的时间内，温度升高可使解吸加快，但会缩短SPME萃取纤维的使用寿命。一般老化温度可作为解吸温度，常选250℃[12~15]，为了更直观快捷的找到最适宜解吸时间，选择所有疏毛吴茱萸挥发性化学成分在GC-MS的TIC图谱中的总峰面积大小为指标，对该方法萃取疏毛吴茱萸挥发性成分的解吸时间进行优化。分别在250℃下解吸1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 min，并且计算TIC图谱中所有峰的总面积如图1所示。从图1可以看出在一定范围内解吸时间加长可以使样品所有峰的总面积增大，但是当时间超过5 min时挥发性成分接近亚平衡状态时，如果样品在相同的条件下解吸，也可以对被分析物进行较准确的测定，所以为了缩短分析时间和更好的维护SPME萃取纤维，以5 min为最佳吸附时间。

　　3.1.3样品的精密度考察在优化条件下，称取0.5 g(每次称样量之间误差在2 mg内)对疏毛吴茱萸样品的挥发性进行6次重复，对主要的挥发性成分进行精密度考察，以RSD表示。结果见表4和图2。

　　3.2疏毛吴茱萸挥发性成分的定性分析采用上述优化后的固相微萃取条件，即在5 ml装有磁力搅拌器的顶空瓶中加入0.5 g的疏毛吴茱萸待测样品，使用PDMS 100 μm 萃取头，在60℃的萃取温度、萃取30 min，GC 解吸5 min，用于GC-MS分析，利用GC-MS方法测定疏毛吴茱萸挥发性化学成分进行定性分析和定量分析结果如图3及表4所示。图1不同解吸时间下TIC图谱中所有峰的总面积对比图图2HS-SPME提取的挥发性成分的色谱叠加图(6次重复)从表2可以看出，疏毛吴茱萸中共分离出85个色谱峰。根据计算机检索(质谱数据库NslT147)和相关的文献报道的结果，共鉴定出77种挥发化学成分。根据面积归一法测其相对含量，共占其色谱流出组分总量的99.43%。图3疏毛吴茱萸挥发性成分的总离子流图本实验所鉴定出的疏毛吴茱萸挥发性化学成分主要有萜类、倍半萜类及其氧化物等物质。疏毛吴茱萸挥发性化学成分主要是月桂烯(3.70%)、反式-罗勒烯(1.71%)、顺式-罗勒烯(14.47%)、β-榄香烯(9.79%)、石竹烯(9.46%)、大根香叶烯(19.77%)、α-布藜烯(3.37%)，α-金合欢烯(7.31%)、γ-榄香烯(2.00%)、环十二烷己酮(2.68%)等。其中含量最高的是大根香叶烯，含量约占香气总量的19.77%，表明该物质是疏毛吴茱萸中最主要的挥发性成分。表4疏毛吴茱萸挥发性的化学成分论文发表核心期刊

　　4结论

　　正交设计是多因素分析的有利工具，它可以很方便地从众多因素中选出主要影响因素及最佳水平组合，从而用较少的实验次数获得较多的信息，为选择最佳实验条件提供可靠的方法。本次实验得到最佳水平组合为使用PDMS 100 μm 萃取头、在60℃的萃取温度、萃取30 min。可以通过较少次数的实验取得最佳萃取效果的组合。解吸时间的考察，我们没有采用正交设计实验而采用了单因素实验是考虑到解吸时间直接影响到解吸程度的大小，解吸不完全不仅会影响方法的灵敏度，而且会污染后续样品使实验准确性很难把握，但长时间高温解吸会缩短萃取纤维的寿命;而在一定的时间内，温度升高可使解吸加快，但会缩短SPME 萃取纤维的使用寿命，单因素实验结果表明5min就可以达到完全解吸。顶空固相微萃取与气质连用是一种快速、简单、需样品量少的测定疏毛吴茱萸挥发性成分的分析方法。本研究确定了疏毛吴茱萸挥发性成分的提取方法并进行GC-MS分析。优化后的固相微萃取主要条件是：萃取头PDMS 100 μm，萃取温度60℃,萃取时间30 min，解吸时间5 min。共鉴定了77种挥发性物质，其中大根香叶烯是含量最高的挥发性物质。

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