作者：杨赤兵，谭大琦，李卫星，姜楠  

【摘要】  目的 观察维A酸（RA）对大鼠胃癌前病变增殖细胞核抗原（PCNA，用增殖指数 PI表示） 和端粒酶活性（用hTERT表示）的影响。方法 采用甲硝基亚硝基胍（MNNG）、0.03%雷尼替丁、56 ℃15%盐水、0.85%脱氧胆酸钠、40%乙醇、饥饱失常等多种因素制作大鼠胃癌前病变模型,免疫组化方法检测正常组、自然恢复组、RA 20 mg/kg和RA 40 mg/kg组大鼠胃黏膜组织中 PI 和 hTERT 蛋白表达情况。结果 正常组和RA 40 mg/kg组PI、hTERT 蛋白阳性率均较自然恢复组低，差异有显著性（P<0.01或P<0.05）。结论 维A酸可能是通过抑制端粒酶及细胞增殖活性，发挥逆转胃癌前病变的作用。

【关键词】  维A酸 ；癌前病变； 增殖细胞核抗原；端粒酶

　　Abstract:Objective To observe the effect of retinoic acid（RA） on proliferating cell nuclear antigen (PCNA, represented with proliferating index, PI) and telomerase activity (represented with human telomerase reverse transcriptase，hTERT) in rats with  gastric  precancerous lesion． Methods  The model was established by MNNG together with other factors including 15% 56 ℃ brine，sodium deoxycholate， 40% alcohol stimulus， 0.03% ranitidine， undue hunger，and overeating． PCNA(converted to PI) and hTERT was detected by immunohistochemical method， in normal group， spontaneous recovery group，and RA（20 mg/kg and 40 mg/kg） group．Results  PI and hTERT of normal group and RA 40mg/kg groups were lower detected than spontaneous recovery group and was significantly different (P<0.01 or P<0.05)． Conclusion  RA  makes GPL reversed in rates by inhibiting  activity of telomerase and cell proliferating．

　　Key words: retinoic  acid； precancerous lesions； proliferating cell nuclear antigen；telomerase

　　利用某些化学物质诱导肿瘤细胞分化为正常细胞或近似正常细胞，已成为抗肿瘤药物研究的热点，维A酸是肿瘤分化诱导剂的代表之一。维A酸对多种化学致癌过程和诱癌作用有抑制作用，具有逆转胃癌前病变大鼠的肠化生和不典型增生作用，对急性早幼白血病M 型的疗效,已被证实和公认［1，2］。为进一步探讨其作用机理，本文观察维A酸对大鼠胃癌前病变增殖细胞核抗原和端粒酶活性的影响，报告如下。

　　1  材料

　　1.1  实验动物SPF级,雄性 Wistar大鼠,6周龄, 体质量100～120 g,由湖北省实验动物研究中心提供 ,生产许可证号：SCXK（鄂）2003-0005。

　　1.2  主要药品及试剂维A酸( RA) ，上海第六制药厂；甲硝基亚硝基胍（MNNG）为 Fluka 公司产品；脱氧胆酸钠 ，北京双旋微生物培养基制品厂；雷尼替丁， 杭州赛诺菲圣德拉堡民生制药有限公司；无水乙醇 ，上海振新兴化工一厂；氯化钠 ，天津化学试剂三厂；即用型PCNA 单抗、即用型端粒酶催化活性亚单位（hTERT）多抗试剂盒、SPDAB 即用型显色试剂盒均购自北京中山生物技术公司。

　　1.3  主要仪器CUT 5062轮转切片机，德国SLEE公司；BX 40系统显微镜，日本OLYMPUS公司；HPIAS1000 型显微摄像全自动图像分析仪，同济千屏影像工程公司。

　　2  方法

　　2.1  造模及给药方法按综合法复制模型 ［ 3］。大鼠50只，随机抽取 11只作为正常对照组，其余 39只用于造模。正常对照组大鼠不做任何处理；造模大鼠每日自由饮用 100 μg/mL MNNG 液（新鲜配制，饮水瓶用油漆涂黑避光），上午用 56 ℃、 ρ=15%的氯化钠液 10 mL/kg 灌胃。摄食为含ρ= 0.03%雷尼替丁的纯鼠饲料,饥饱相间，进食2 d的当天下午，用 ρ=0.85%脱氧胆酸钠溶液按10 mL/kg 灌胃；禁食1 d的当天下午，用 φ=40％乙醇10 mL/kg 灌胃，持续6个月(造模过程中死亡6只大鼠)。6个月末时,取正常和造模大鼠各1只杀检,观察组织病理学变化，确认模型是否成功。模型成功后，将造模存活的大鼠,随机分为:自然恢复组12只、RA 20 mg/kg和RA 40 mg/kg组各10只。　　

　　正常对照组和自然恢复组大鼠给蒸馏水10 mL/kg； RA 20 mg/kg和RA 40 mg/kg组大鼠分别给0.2% RA和 0.4% RA 10 mL/kg灌胃,每日1次，连续3个月(自然恢复组大鼠死亡 4只)。末次给药后,所有动物禁食1 d，放血处死，剖腹取胃，沿胃大弯剪开，生理盐水冲洗，肉眼观察，平铺于硬纸板上，于胃窦部剪取组织1块，Φ=4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片 5 μｍ,免疫组织化学染色。

　　2.2  检测方法免疫组织化学用 SP法，按试剂说明书操作，DAB 显色，PBS 代替一抗作阴性对照，已知阳性切片作阳性对照。免疫组化染色阳性信号为棕色，PCNA 阳性物质定位于细胞核， hTERT 阳性物质定位于细胞质。采用显微摄像计算机图像分析系统，每张切片检测5个视野（×400）。计算PCNA阳性细胞数以及腺上皮细胞总数（每例≥200 个）,求出细胞增殖指数（PI）， PI=PCNA 阳性细胞数/腺上皮细胞总数×100%。hTERT：无阳性细胞或阳性细胞数<25%为（-）,阳性细胞数25％～50%为（＋），阳性细胞数 50％～75%为（＋＋），阳性细胞数>75%为（＋＋＋）。

　　2.3  统计学处理PI 值的比较，采用t检验； hTERT 蛋白表达阳性率的比较，采用χ2检验（校正χ2值计算），以P<0.05为差异有显著性。

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