作者：周清， 陈剑，张静辉， 杨水平， 陈敏
【摘要】 目的 观察安贺拉滴眼液应用于兔干眼症治疗的免疫病理学变化，初步探讨安贺拉滴眼液治疗干眼症的可能机制。方法 新西兰白兔20只，制作碱烧伤干眼模型，随机分为对照组和安贺拉组，分别滴生理盐水和安贺拉滴眼液。用药４周后应用印迹细胞学和免疫病理学方法检测结膜杯状细胞密度、MUC5AC阳性细胞率和炎性细胞浸润密度。结果 对照组结膜炎性细胞浸润密度高于安贺拉组，安贺拉组杯状细胞密度和MUC5AC阳性细胞率均大于对照组（P<0.05）。结论 安贺拉滴眼液可以降低兔眼表的炎症反应，促进杯状细胞增殖，在干眼症治疗方面具有一定的应用前景。
【关键词】 安贺拉滴眼液；干眼症；兔；免疫病理学
Abstract:Objective To discuss the mechanism of ketorolac tromethmine eye drops in rabbits dry eye with alkali burns in conjunctiva by observing the immunopathologic process after it was used. Methods Twenty rabbit models were established by burning with alkali in conjunctiva, and then divided into two groups randomly: the experimental group treated with ketorolac tromethmineeye drops and the control group treated with saline. By using immunopathologic techniques and impression cytology test, density of goblet cell, positive rate of MUC5AC and density of inflammatory cell in conjunctiva were studied the 4th week after drug used. Result The density of goblet cell, and positive rate of MUC5AC in experimental group was higher than that of control group and lower in the density of inflammatory cell（P<0.05）. Conclusion Ketorolac tromethmine eye drops can reduce ocular surface inflammation and increase the number of goblet cells in rabbits, suggesting it is valuable to dry eye.
Key words: ketorolac tromethmine；dry eye；rabbit；immunopathology
干眼是指任何原因引起的泪液质或量及动力学的异常,导致泪膜不稳定和(或) 眼表面的异常,并伴有眼部不适症状的一类疾病。干眼的主要症状有眼部干燥、异物感、视疲劳、畏光及视力下降等,轻者影响工作和生活,严重者可导致眼表尤其是角膜组织干燥、融解、穿孔,严重危害视功能［１］。干眼作为最常见眼表疾病有日趋增多的趋势，其药物治疗方法多种［２］：泪液替代疗法、黏液溶解药、局部自家血清、抗生素等。随着干眼发病机制的深入研究，现已认识到由炎症介质介导的炎症反应参与几乎所有类型干眼的病理生理过程。本研究采用新型药物——安贺拉滴眼液作用兔干眼模型，研究其疗效及可能的作用机制。
1 材料与方法
1.1 主要仪器与试剂Leica MEL53 型眼科手术显微镜 （瑞士WILD LEITZ 公司），YZ5CSI型裂隙灯显微镜（苏州医疗仪器厂），Olympus10AK照相显微镜（日本欧林巴斯光学公司），低温恒冷切片机 （美国Leica公司）,安贺拉滴眼液（Acular,美国Allergan公司产品），16mm×6mm的滤纸条，1mol/L的NaOH（广州化学试剂厂），1%荧光素钠溶液，1%虎红溶液（广西梧州制药股份有限公司），免疫组化试剂盒和MUC5AC抗体（美国Sigma公司）。
1.2 动物选择与分组 健康成年新西兰白兔20只，雌雄各半，体质量2.0～2.5 kg。随机分为实验组和对照组，每组10只，右眼为实验眼。购自广东省医学实验动物中心，合格证号:SCXK (粤)2003-0002， 粤监证字2006A001。
1.3 实验方法 50 mg/2 mL盐酸氯丙嗪＋100 mg/2 mL氯氨酮肌肉注射麻醉兔,切除右眼第三眼睑，并用2张16 mm×6 mm的滤纸条蘸1 mol/L的NaOH溶液置于距兔角膜缘上方2 mm的结膜上，90 s后立即用100 mL 生理盐水反复冲洗结膜囊。术后对照组局部应用生理盐水滴眼，每日3次；实验眼局部应用安贺拉滴眼液,每日3次。用药4周后行结膜印迹细胞学检查，并取病变区结膜行组织病理学检查和免疫组化染色检测特异性黏蛋白MUC5AC的表达。
1.3.1 印迹细胞学检查及PAS染色 将孔径为0.2 μm的醋酸纤维膜剪成3 mm×3 mm大小，浸入蒸馏水3～4 h，以消除滤纸表面活性，取出晾干高压消毒备用。检查前结膜囊先滴1％爱尔卡因1滴，5 min后，滤纸吸去穹隆部泪液，将醋酸纤维膜的粗糙面贴于距上方角膜缘2 mm的球结膜表面，轻轻加压，3～5 s之后撕下，然后于其左右相邻的区域再各贴一张，φ=95％乙醇固定10～30 min，然后依次用0.5％高碘酸氧化，过碘酸希夫染色剂（periodic acid Schiff staining，PAS）染色，偏重亚硫酸漂洗，苏木素复染，二甲苯透明，中性树脂封片，置于双目光学显微镜下观察上皮细胞的连接，胞核胞浆的颜色，核浆比例（N/C），上皮细胞角化以及杯状细胞密度。
1.3.2 组织病理学检查 用药4周取病变部位球结膜，生理盐水冲洗干净后放入10%甲醛固定液固定。流水冲洗固定组织过夜。依次进行乙醇梯度脱水，φ=70%乙醇15 s，80%、90%、95%、100%乙醇各3 h。二甲苯透明3次，每次10 min。从低熔点石蜡到高熔点石蜡浸蜡共3次，每次1 h。将浸蜡后的组织放入包埋盒内，倒入熔化的高效切片石蜡，待凝固后取出石蜡块。将石蜡块安装在切片机的组织固定架上用，调节切片厚度在4～6 μm每个石蜡块切2～3张切片。
1.3.3 免疫组织化学染色 将组织片放入20 ℃温水中展开，贴于玻片上，放入烘箱内烘干5 min，依次放入二甲苯脱蜡和95%乙醇各2次，每次1 min。PBS（0.01 mol/L，PH 7.4）漂洗3 min × 3；4 ℃1% TrisTriton 100通透5 min，用PBS漂洗3 min ×3；加20 μL即用型过氧化物酶阻断剂于室温下孵育10 min，用PBS漂洗3 min× 3，以消除内源性过氧化物酶的活性；加20 μL非免疫动物血清于室温孵育5 min，以减少非特异性背景染色；倾去血清吸去多余液体，滴加一抗（MUC5AC）于4 ℃孵育12 h，用PBS漂洗3 min×3；加20 μL生物素标记的二抗，于室温下孵育10 min，用PBS漂洗3 min× 3；加20 μL辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素于室温下孵育10 min，用PBS漂洗3 min ×3；加新鲜配制的DAB显色液显色，显微镜下观察结果，1～2 min水洗终止反应；苏木素复染核15～30 min，染色过深者用盐酸酒精漂洗；每一批实验均设有阳性及空白对照，阳性对照：采用已知阳性的胃癌切片（由试剂公司提供）；空白对照：以PBS代替一抗。
1.4 结果判定
1.4.1 印迹结膜杯状细胞观测 分级根据NELSON’s分级标准进行分级［３］：0级：结膜上皮细胞形态正常，层次大小一致，胞浆蓝绿色，N/C为1∶2，杯状细胞密集分布；1级：结膜上皮细胞轻度扩大，胞浆蓝绿色，N/C为1∶3，杯状细胞开始减少密度下降；2级：所有结膜上皮细胞均扩大，变扁平，胞浆蓝绿色或粉红色，N/C为1∶4 或1∶5，轻度角化。杯状细胞明显减少；3级：结膜上皮细胞浆内出现颗粒状物质，核固缩崩解，上皮细胞胞浆呈粉红色，N/C为1∶6或1∶8，出现不同程度的角化，杯状细胞完全丧失，视野下不见杯状细胞。 结膜杯状细胞计数方法：计算每个动物所取3张标本中共10个高倍镜（400×）下杯状细胞数目总数的平均值。
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