【关键词】  肿瘤干细胞 分离鉴定 技术方法

　　肿瘤干细胞（Cancer Stem Cell,CSC）是目前肿瘤研究中的热点问题。依照肿瘤干细胞观点，肿瘤细胞呈异质性，少数的CSC决定了肿瘤的形成、复发及转移，这无疑是对传统的肿瘤治疗形成很大的冲击，因此也是目前争议很大的问题。1997年第一次分离出肿瘤干细胞-血液系统急性髓样白血病肿瘤干细胞，随后实体肿瘤中肿瘤干细胞的研究也逐步开展，已从人脑肿瘤、乳腺癌、肝癌、肾癌等患者的癌组织及细胞系中成功分离、鉴定了肿瘤干细胞。可见为弄清楚CSC的本质，首当其冲的任务是将肿瘤组织及细胞系中的CSC分离、纯化并进行鉴定。现结合文献资料将各种分离鉴定方法总结如下，以便对CSC更好地进行研究。
  
　　1  肿瘤干细胞的分选方法
      
　　目前文献中分离CSC的方法主要有利用肿瘤干细胞细胞表面标志物（cell-surface marker）的分选及根据其生物学特性进行的功能分选两大类。
  
　　1.1  利用细胞表面标志物分选  目前发现的肿瘤干细胞多是利用marker分选发现的。实体瘤CSC 的标志物及分离鉴定方法均借助了正常干细胞的研究，干细胞的严格鉴定和分离也仅在极少的组织中完成，许多实体组织自身的干细胞表面标志物尚未确定。因此对CSC 的表型分离鉴定还仅限于少数实体肿瘤。分离出的带有此标志物的细胞往往是正常组织干细胞也具有的。因此，这就涉及到SC与CSC之间的差别。这方面的进展还只是起步阶段。有学者认为，既然肿瘤干细胞属于未分化细胞，那其表面的标志物应当很少甚至没有。一旦细胞具有了表面标志，就不能再称其为“干细胞”。据此认为目前根据marker分离出的应该属于肿瘤干细胞下一个级别的细胞——肿瘤起始细胞。尽管各家对CSC的定义、阶段及分化时间有异议，但一致公认根据marker分离出的目的细胞往往处于决定细胞分化方向的重要阶段，这部分细胞对对肿瘤的形成发展、放化疗抵抗，术后及放、化疗后复发非常重要。因此对这一特殊细胞亚群的研究将对肿瘤研究有极大推动。Marker的确定是很困难的事情，对肿瘤干细胞marker的研究多沿用干细胞的marker，CD133标记分子在目前CSC研究中应用较多。
      
　　利用marker分选的原理是：假定某抗原分子阳性或阴性的细胞为该肿瘤细胞中的CSC，以相应抗体与抗原结合（预先以一抗与细胞表面分子结合，再以二抗与之结合），再经特定仪器和设备将阳性与阴性细胞分离开来得到目的细胞。目前常用的有荧光激活细胞分选(Fluorescence activated cells sorting,FACS）和磁性激活细胞分选(Magnetic activated cells sorting,MACS）。
      
　　细胞亲和板结合分离法也是利用抗原抗体反应，将具有某种抗原标志的细胞结合到平皿上，从而与悬浮细胞中的阴性细胞分离。有些学者利用这种方法来分离肿瘤干细胞。

　　1.1.1  磁性激活细胞分选(MACS)  磁性激活细胞分选术(MACS）是高效简捷的免疫细胞及其它细胞的分离纯化方法，因其应用免疫磁珠来进行分选，故又称免疫磁珠分选。原理是已包被一抗的磁珠与细胞表面相应分子特异性结合（直标），或者已包被二抗(羊抗小鼠或羊抗大鼠)的磁珠与预先已与细胞表面分子特异结合的一抗结合（间标）。让标记好的细胞经过置于磁场的分离柱，磁珠携带与之结合的细胞吸附于分离柱内面，未结合细胞则经分离柱流下。再经洗涤，实现阳性细胞分离或阴性细胞的分离，从而纯化CSC。若加以相应荧光抗体，则利用流式细胞仪来评价MACS的分选效率。发表论文网站
      
　　目前报导经MACS成功分选肿瘤干细胞的文献较多，例如以CD133免疫磁珠分选喉癌Hep-2细胞系中CSC［1］，关于MACS分选效率报导不一。原代分离的效率在46.9%～79.8 %［2］。分选脐血单个核细胞，CD133表达率为86.04%。有学者从人胎脑中分离纯化CD133细胞，分选后所得细胞纯度为85.57％，回收率为62.3%［3］；CD133免疫磁珠分选喉癌Hep-2细胞的分选效率达90.26%。考虑可能原因为所分选的细胞不同或所用的仪器不同，或为分选率和细胞得率的区别。
免疫磁珠分选纯度比流式低，不过对细胞活性影响小。磁珠直径仅50 nm，体积约小于真核细胞的百万分之一，不会对细胞造成机械性压力；其组分多为氧化铁和多糖，可被生物降解，因此不影响细胞的生理功能及活力［4］；分选过程无菌，便于后续培养。如果marker已知，免疫磁珠法有很大的优越性。
      
　　MACS在实际应用中也受到以下因素的限制：分选前的细胞收集、处理过程耗时较长；分选设备及磁珠价格昂贵；分选柱的容积限制了分选细胞的数量。为后续实验工作带来了一定的限制。
  
　　1.1.2  荧光激活细胞分选（FACS）  荧光激活细胞分选（Fluorescence activated cells sorting，FACS）是利用流式细胞仪来进行的分选方法，故又称流式分选。流式细胞仪分选特定标志细胞的原理为：预先将特定抗体与待分选细胞一起孵育，结合后，利用流式细胞仪的适合电压，将结合抗体与未结合抗体的细胞分为两群，从而得到不同表面标志的亚群细胞。以被公认为CSC标志物的CD133为例：流式细胞仪分检出CD133＋及CD133-两大类细胞，分别进行培养，发现CD133＋细胞可以增殖、分化，长期传代；而CD133-细胞则经过几代的传代就死亡。CD133＋细胞可以使异种移植体成瘤。这证明了CD133＋细胞富集CSC。其他还有一些CSC的表面标志物，如神经胶质瘤细胞中的Nestin等均可用FCM来进行检测。
      
　　FACS收集细胞纯度较高，分选较为简捷，但因对分选设备无菌条件要求高，目前国内尚不能广泛开展，不利于分选细胞的后续培养。且此法是在分选血细胞的过程中建立起来的分选方法,其使用的高压小直径的液流可能是许多肿瘤细胞不能承受的,对细胞表面标志有破坏。因而可能会影响分选细胞活性，降低分选后细胞得率。
  
　　1.1.3  亲和板结合分离法  亲和板结合分离法在上世纪70年代就已展开，也是利用抗原抗体结合而分选肿瘤干细胞的一种方法。周思朗等以此法分离大鼠肝癌干细胞［5］，操作方法大体为：将纯化的羊抗鼠IgG加入无菌平皿中，加缓冲液3ml，4℃过夜，次日吸弃上清液，磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，用含体积分数为1%小牛血清的PBS室温下孵育15min，PBS洗3次，4℃保存备用。取肿瘤细胞，每1×106个细胞中加入待测肿瘤干细胞各个表面标记物单克隆抗体工作液100μl,4℃作用1h，培养液悬浮细胞；吸1.5×107～2×107个细胞加人到上述准备好的塑料平皿中，用Hanks液稀释为3ml，轻轻摇匀，4℃下作用1h。吸出悬液中细胞标记为阴性细胞，洗脱粘附在平皿上的肿瘤细胞，标记为阳性细胞，分别继续常规培养，发现CK7－、Thy-1＋、AFP＋细胞跟对应亚群细胞比较，体外增殖能力较弱，倍增时间长，最大倍增倍数小。因此认为这三种细胞具备大鼠肝癌干细胞的初步特征。
      
　　简便亲和板结合分离法易行，但准确率低于FACS和MACS。可作为后两者分选前的粗略分选。
  
　　1.2  利用生物学特性进行的的功能分选（SP分选）  肿瘤干细胞理论中，有一种观点倾向于肿瘤干细胞并非形态学概念，而应属于功能学的范畴。跟这一观点对应的是侧群细胞（Side Population，SP)的发现。因此又将肿瘤干细胞的功能分选称为SP分选。
      
　　SP分选常用的染料为核酸结合染料Hoechst33342，其在紫外光激发下可发出蓝光(波长450 nm 左右)和红色(波长650 nm 左右)两种荧光。SP细胞在肿瘤细胞中占极少量，拥有耐药泵，有拒染Hoechst33342等染料的特性，能将染料泵出而不发出荧光［6］。根据这一特点，应用流式细胞仪可将未被Hoechst33342等染色的细胞群与绝大部分肿瘤细胞分离开来，实现SP分选。SP细胞外排染料的机理是这部分细胞高表达ATP结合盒（ATP-binding casette,ABC）转运蛋白,包括P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）、乳腺癌耐药蛋白（Breast cancer resistance protein,BCRP/ABCG2）、ABCG1等能将药物及毒物“泵出”胞外的膜蛋白，故而对化疗药物不敏感，是CSC化疗耐药的原因。　神经母细胞瘤标本、胶质瘤、乳腺癌［7］和肺癌细胞系中均发现了SP 细胞［8］；大鼠C6胶质瘤细胞系也分离出SP细胞,在含有10% FBS的培养基中可长期保持干细胞特性比非SP细胞具有更强的致瘤能力,还能同时表达双向分化的标志［9］；Wang等从5种鼻咽癌细胞系中检测到SP细胞存在，其中CNE-2细胞系中分离出的SP细胞表现出干细胞特性，具有强的体内致瘤性，且高表达细胞因子19，可能是鼻咽癌CSC的一个表面标志。
      
　　SP分选也存在着一定的局限性：拥有耐药泵并非肿瘤干细胞的独特特征，干细胞本身也有耐药泵。因此SP细胞是否属于CSC尚需要进一步论证。染料本身对CSC可能有一定的毒性作用，而使CSC失去拒染能力，被排除在SP之外；被筛选到SP之内的CSC也可能由于染料的作用，影响其进一步的培养研究。
      
　　SP分离的最优条件为355 nm左右的紫外光激发，但紫外光需要特殊的氪气或氩气激光光源、水冷却系统及相应的滤片等设备，这些设备价格昂贵，体积庞大，目前国内能进行SP分选的流式细胞仪尚不多。有报导利用Rho123(蓝光激发)、DyeCycle Violet（紫光激发）等染色剂对肿瘤细胞进行SP分选，且与Hoechst33342分选SP比例类似。由于普通的流式细胞仪具有蓝光、紫光激发功能，有望将SP技术得以推广应用。
  
　　2    肿瘤干细胞的鉴定方法
      
　　经各种方法分离、筛选出来的细胞究竟是不是肿瘤干细胞尚需要进一步鉴定。目前从形态学来鉴定干细胞尚有一定困难，主要是从功能学方法来进行鉴定。
      
　　多数文献中报导CSC的数量较少,占细胞总体的10 %以下：乳腺癌ESA+Lin-CD44+CD24-/low细胞占小鼠移植乳腺癌细胞的2%［10］；结肠癌干细胞中CD133＋细胞群占2.5%［11］；喉癌Hep-2细胞系中CD133＋比例为3.15。也有学者认为肿瘤干细胞并不一定是稀有细胞，在某些肿瘤组织或细胞系中，检测到其所占的比例较大。Singh等报导因病理类型及级别不同脑肿瘤干细胞所占比例从0.3%到25.1%不等;Galli等报导多型胶质母细胞瘤中为0.5%～30%,髓母细胞瘤中为50%～80%［12］。
      
　　常采用检测分选细胞是否具有自我更新能力与不断分化能力来测定其生物学特性，并与对应的细胞群或未分选细胞进行比较。体外克隆、传代实验能直接证明这些细胞是不是能自我更新。CSC在含生长因子的SFM(无血清维持干细胞未分化状态，添加的生长因子则能促进CSC 的增殖)中能快速增殖形成细胞球，若将此细胞球打散重悬制成单细胞悬液，能够连续传代形成细胞球，此培养特性反映了细胞的自我更新能力和无限增殖能力。细胞球细胞在不同诱导条件下可分化为不同细胞，反映了CSC的多向分化潜能。

　　2.1  细胞增殖能力  根据增殖能力不同鉴定是否CSC是目前的主要方法。肿瘤干细胞在特定的生长环境下，具有很强的自我更新和增殖能力。而非CSC则没有增殖能力或者经过几代传代则死亡。Singh等通过有限稀释实验和亚克隆培养分析证实：在稀释为每孔100个细胞时,髓母细胞瘤平均形成20.27个肿瘤球,纤维型星形细胞瘤为5.85个,作为对照的正常神经干细胞仅2.88个。培养CD133＋胶质瘤干细胞发现其具有很强的自我更新和增殖能力,而对应的CD133-肿瘤细胞则贴壁生长，不分裂、不增殖。即使在含血清培养基中培养胶质母细胞瘤来源的CD133＋细胞，也可以长期保持未分化状态［13］。喉癌Hep-2 细胞中CD133＋细胞在加入生长因子的无血清培养液中生长，经MTT比色法测定，其增殖能力强于CD133-细胞和未分选细胞。
  
　　2.2  多向分化能力  除了具有自我更新能力外，肿瘤干细胞还应具有多向分化能力。除了保持原有CSC数量的稳定，还要分化为子代细胞，直至终末的肿瘤细胞以维持肿瘤的生长。CSC分化期间，表面标志是不断变化的。根据这一原理可对分离出来的CSC进行了分化能力的检测。恶性胶质瘤患者标本及恶性胶质瘤细胞株U251中CD133＋细胞可分化为神经元和星形胶质细胞［14］。人视网膜母细胞瘤组织中存在的非黏附性细胞球样未分化细胞，在体外诱导下可形成不同的视网膜细胞［15］；CD133＋喉癌Hep-2细胞在含10%胎牛血清的培养基中生长，CD133比例逐渐减少，到第12天时，达到分选前水平。
　2.3  体内成瘤实验  行体外实验在一定程度上可证实前面任何方法分离出来的某些细胞亚群具有CSC的生物学功能，动物体内成瘤实验才是必须进行的最重要的证据。肿瘤干细胞具有比非肿瘤干强得多的体内致瘤能力。将分离出来的各细胞亚群按不同细胞浓度接种于动物体内，观察是否成瘤及肿瘤生长，比较各组成瘤能力，从而筛选出优势细胞表面标志。或者将几种优势细胞表面标志进行组合(例如A+B-C+)，筛出各种组合的细胞群，按不同浓度组接种NOD/SCID小鼠比较各细胞群成瘤能力，确定目的细胞。形态学上，成瘤组织应与原发瘤相似。1994 年Lapidot 等发现CD34+ CD38-急性白血病肿瘤细胞接种NOD/ SCID 小鼠能增殖形成肿瘤［16］,从而发现了肿瘤干细胞的存在。随后的研究中逐步发现实体肿瘤干细胞的成瘤能力：具有ESA+Lin－CD44+CD24-/low表面标志的乳腺癌干细胞是唯一在连续移植中具有致瘤能力的细胞,只需100～200个细胞即可在小鼠乳腺中再形成肿瘤；Singh等报道只需脑肿瘤中100个CD133＋细胞移植入NOD/SCID鼠脑,3～6月后就会长出肿瘤,通过免疫组化染色证实与患者原始肿瘤有高度相似性，连续移植重复出现，而植入105个CD133－细胞也未见肿瘤形成,提示脑肿瘤细胞的功能异质性。喉癌Hep-2细胞系中CD133＋细胞具有很强的致瘤能力，与未分选细胞及CD133-细胞，有显著性差异。从神经胶质瘤U373和乳腺癌细胞系MCF7及前列腺癌细胞中分离的SP细胞，均有比非SP细胞更高的致瘤性。发表论文网站

　　3  兼具分选和鉴定肿瘤干细胞的方法
      
　　根据肿瘤干细胞自我更新和多向分化、抵抗放化疗等特点，可以进行肿瘤干细胞的富集。同时，由于富集细胞体现了CSC的相应特点，因此从相对应的角度起到了鉴定作用。
  
　　3.1  悬浮球培养法  肿瘤细胞体外培养可以形成肿瘤球（sphere）的特性被用来研究肿瘤细胞自我更新能力或用其作为鉴定CSC的方法之一。此法基本是沿用干细胞的培养方法。其原理为：肿瘤细胞在添加了生长因子的无血清培养基中生长，其中的CSC增殖而形成致密球状，保持不分化状态；而非CSC则贴壁生长，且在无血清条件下生长速度缓慢。如：在此条件下培养大鼠C6胶质瘤细胞系,培养出悬浮生长的的细胞球，经验证其具有脑肿瘤干细胞球的特征［17］。
      
　　分选后的假定肿瘤干细胞细胞是否具有CSC特性，也经常采用观察其是否可以形成sphere的方法。原理同分选前无血清悬浮培养法。无血清培养条件下，肿瘤干细胞可维持肿瘤细胞的未分化状态，形成肿瘤球。将此悬浮球在加入表皮生长因子、碱性成纤维生长因子等的培养基中培养，可促进肿瘤细胞增殖，并传代多次；置于含血清培养基中，则可发生多向分化；接种于裸鼠，可体内成瘤。因此，目前脑肿瘤干细胞的研究多沿用此法。CD133＋ 胶质瘤干细胞、乳腺癌ESA+Lin－CD44+ CD24-/low细胞、喉癌Hep-2细胞系中CD133＋细胞均可形成干细胞球，CD133＋结肠癌细胞在体外无血清条件下可以呈细胞球生长1年，并能保持原代的形态学特征。
  
　　3.2  有限稀释法  有限稀释法是测定单个细胞增殖能力的有效方法。如软琼脂克隆形成实验。肿瘤细胞群体中的单个细胞形成克隆潜能并不相同，其增殖潜能也不同。能形成完全克隆的细胞则是CSC。筛选分离原理为将肿瘤细胞单细胞接种于96孔板，筛选出具有连续克隆能力的细胞进一步筛选扩增，进行体内外实验，最后再鉴别marker［18、19］。体外克隆形成能力通常与异种移植体内成瘤能力相一致。如：鼠黑色素瘤BL6F10细胞的CD133＋和+细胞在软琼脂培养皿上细胞克隆形成率以及在小鼠体内致瘤能力分别高于CD133-和CD44-细胞［20］。

具体操作为：取对数生长期的第10次传代细肿瘤细胞，用胰蛋白酶消化、离心、计数；将细胞稀释成100μl约含50个细胞，打匀；用20μl移液枪吸取细胞悬液点入96孔板，每孔约2μl。倒置显微镜下观察，仅向单个细胞的孔中加入200μl培养液，然后置CO2培养箱37℃培养。标记单细胞培养孔，待孔内细胞增殖至大部分孔底盖满时，经胰酶消化、分离转种植到24孔板上扩大培养。最后形成几个克隆集落，选取其中形态差别最大的两类细胞株，代表了两组不同的细胞亚群，继续进行单细胞亚克隆培养以确定两组细胞间差别。将细胞球悬浮法及有限稀释法结合起来进行克隆球的传代培养，可以扩增肿瘤干细胞。将肿瘤干细胞球打散，单细胞接种于96孔板中，可观察肿瘤干细胞克隆成球过程［21］。
      
　　实验验证有体外的集落形成试验和体内的脾集落鉴定。例如小鼠骨髓瘤中只有1%～0.01%的细胞能在软琼酯中形成集落，同样肺癌、卵巢癌或神经母细胞瘤在软琼酯中具有集落形成能力的也只有0.1%～0.02%的比例。白血病细胞也只有1％～4%的细胞在体内能形成脾集落。据此现在认为少数肿瘤细胞有持久的致瘤能力和形成肿瘤能力,它们就是肿瘤干细胞。其他瘤细胞只有有限的自我更新能力。
      
　　如果marker已知，MACS及FACS有很大的优越性，分选的细胞纯度较高，而且高效快捷。但在marker未知的情况下，则可先以有限稀释法做初选，得到单细胞克隆，再进行免疫磁珠分选即可得到较多的CSC。肿瘤干细胞有可能会分化，那么单克隆实验条件下，会出现具有不同marker的细胞，包括肿瘤干细胞、过渡细胞和其它各类肿瘤细胞。因此，有限稀释法在得到单细胞克隆的同时，还可同时鉴定肿瘤干细胞的分化能力。

　　3.3  利用放化疗抵抗的特点  肿瘤干细胞可能与正常干细胞相似，通常处于慢周期，对接受放射线损伤的几率较其它多数细胞小，且由于其抗凋亡蛋白及ABC转运蛋白的高水平表达,对化疗药物的敏感性比成熟细胞低。传统的放化疗可以杀灭绝大多数非CSC，但对CSC并不起作用，故放化疗后可导致CSC的富集，成为肿瘤复发与转移的基础。
      
　　有报导用悬浮培养联合化疗药物筛选小鼠乳腺癌TM40D干细胞。先采用无血清悬浮培养法富集肿瘤干细胞，再分别加入不同浓度的紫杉醇和表柔比星作用24 h，杀死非CSC，而CSC则逃脱了化疗药物的杀伤作用得以存活。继续无血清培养，使CSC得以扩增。如此得到富集表面标志为CD44+CD24－的细胞，经检测具有CSC特性［22］。
      
　　放化疗后存活肿瘤细胞是否能保持原有的生物学特性有关。化疗药物作用后，存活的肿瘤细胞恶性程度是有所降低，还是会发生进一步的基因突变，得到恶性程度更高、具有更强抵抗化疗能力的CSC，尚需进一步的研究探讨。
      
　　实体肿瘤中CSC 的分离纯化及鉴定将为实体肿瘤的临床诊断、治疗、预后及其基础研究带来突破性进展，有利于CSC 分子调控机制等后续研究工作顺利进行，进而为肿瘤发病机制及临床靶向治疗提供新的思路和方向，是目前实体肿瘤干细胞研究中的重要内容。

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