【摘要】  　　目的 探讨脑缺血/再灌注损伤自由基的改变及其与组织损伤间的关系。方法 采用大鼠缺血－再灌注动物模型，观察缺血－再灌注损伤过程中自由基指标、NO的改变，脑组织损伤及脑微循环障碍的情况，以及中药羌活石菖蒲的保护作用。结果 脑缺血/再灌注损伤过程中脂质过氧化增强，LPO明显升高，SOD明显降低，脑组织损伤明显，脑微循环严重障碍。结论 脑缺血/再灌注损伤过程中自由基的改变明显，自由基损伤与组织损伤间关系密切，中药羌活石菖蒲对脑缺血/再灌注损伤有一定保护作用。为临床脑外伤等疾病的治疗提供实验依据。

【关键词】  脑缺血/再灌注损伤 自由基 羌活 石菖蒲

　　组织器官的血液供应与微循环的功能状态密切相关，脑微循环障碍会导致脑组织细胞缺血缺氧。通常微循环障碍可分为三个阶段：一是缺血性障碍，二是无复流现象，三是再灌注损伤。缺血/再灌注损伤是微循环障碍的严重阶段，常常是患者病情加重甚至死亡的主要原因。脑缺血/再灌注损伤是许多疾病如：脑外伤、休克、脑血栓等疾病中的病理生理过程，本研究观察脑缺血/再灌注损伤过程中自由基的改变，探讨自由基损伤与组织损伤间的关系。为临床脑外伤等疾病的治疗提供实验依据。

　　1  材料和方法

　　1.1  实验动物  标准动物SD大鼠30只，随机分为三组：（1）对照组；（2）缺血－再灌注组；（3）治疗组，每组动物各10只。

　　1.2  缺血－再灌注动物模型的制作（按改良的pullsinell法）  大鼠腹腔麻醉，用双极电凝凝固双侧椎动脉，然后用动脉瘤夹夹闭双侧颈动脉，造成4根动脉闭塞全脑缺血（30min）。松开动脉瘤夹，为再灌流期（60min）。对照组动物作相同手术，但不阻断血管。各组动物按时处死，进行相应检测。

　　1.3  给药方法  治疗组于动脉阻断前30min从尾静脉注射羌菖注射液，给药剂量为10g/Kg.其余组注射等量生理盐水。

　　1.4  脑组织过氧化脂质（LPO）测定  组织匀浆均在生理盐水中，用组织匀浆器制备。脑组织超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化脂质（LPO）测定，均采用北京邦定泰克生物技术公司试剂盒。SOD为黄嘌呤氧化酶反应抑制法，测定1%脑组织匀浆；LPO为硫代巴比妥酸法，测定10%脑组织匀浆。

　　1.5  脑组织一氧化氮测定  采用北京邦定泰克生物技术公司试剂盒。硝酸还原酶法；测定10%脑组织匀浆。

　　1.6  脑组织及微循环超微结构观察  动物处死后，将取下的脑组织迅速放于3％的戊二醛固定液内,固定24h。用磷酸缓冲液清洗,再用1%锇酸作后固定.双蒸水清洗,环氧树脂618包埋.半薄切片定位后,LKB作超薄切片,醋酸铀和枸橼酸铅复染,H-600电镜下观察。如何快速发表论文

　　2  结果

　　2.1  脑组织过氧化脂质（LPO）含量  脑缺血30min再灌流60min组，过氧化脂质（LPO）含量较对照组明显升高，而SOD含量较对照组明显降低，两组间有显著差异（P＜0.05）。治疗组过氧化脂质（LPO）含量明显下降而接近对照组，SOD含量明显回升，亦接近对照组，与缺血组之间亦有显著性差异（P＜0.05）,见表1。

　　表1  各组大鼠脑组织SOD、LPO测定结果（略）

　　*P<0.05; **P<0.01

　　2.2  脑组织一氧化氮测定结果  脑缺血30min再灌流60min组，NO含量较对照组明显下降，两组间有显著差异（P＜0.01），治疗组NO含量明显回升（P＜0.01），但与对照组仍有显著差异(P＜0.05),结果见表2。

　　表2  脑组织NO测定结果（略）

　　*P<0.01

　　2.3  脑组织超微结构改变  对照组神经元形态结构正常，核膜清楚核染色质分布均匀，胞浆内细胞器较丰富，线粒体和粗面内质网肿胀等形态结构完整，突触小泡分布均匀。脑缺血30min再灌流60min组神经元显示程度不同的肿胀和退行性变，染色质分布不均，异染色质凝聚且边集，线粒体和粗面内质网肿胀，线粒体腔扩张，突触小泡聚集。治疗组上述改变明显减轻。

　　2.4  脑微循环超微结构改变  脑缺血30min再灌流60min组脑毛细血管形态不规则，管腔畸形。毛细血管内皮细胞变性，胞浆内空泡。内皮细胞胞核固缩，染色质边集，核膜凹陷。胞浆内细胞器减少，线粒体、粗面内质网（RER）变性。毛细血管基底膜（BM）欠清晰，毛细血管管腔中红细胞（RBC）变形、聚集。

3  讨论
      
　　业已证明，缺血、缺氧引发的组织和器官损伤，可以发生在缺血时，但更主要是发生在再灌注时。对脑缺血/再灌注损伤的研究日渐深入，认为其损伤机制主要为氧自由基介导的脂质过氧化反应。当脑组织缺血缺氧时，产生的无氧代谢产物聚集，恢复血液灌流后，氧分子进入脑组织，发生超氧化物阴离子自由基反应，自由基产生量过多和抗氧化系统受损，导致脂质过氧化反应，造成细胞膜、线粒体、溶酶体等生物膜损伤，最终导致细胞肿胀变性、坏死。构成再灌注损伤。

　　损伤机理过程中包含了如下几个环节：（１）缺血再灌注后引起血循环中氧自由基升高，中性粒细胞激活、释放细胞因子，由此导致血脑屏障开放和脑内自由基连锁反应。（２）细胞因子等诱导iNOS表达。（３）自由基通过引发兴奋性神经递质过量释放等机制导致神经元钙超载，激活NOS。（４）过量生成的NO与O-２结合生成毒性更强的ONOO-,导致神经蛋白质、核酸及脂质破坏。（５）线粒体不仅作为能量转换器而且涉及到凋亡的调控,线粒体的某些成分直接参与了凋亡的调控。脑组织氧和ATP的储备很少，因而对缺氧耐受性差。脑细胞线粒体能量代谢障碍可能在在脑缺血/再灌注损伤中也起了重要作用。 也是引起缺血/再灌注损伤后脑细胞凋亡的重要原因。
   
　　本组实验发现，缺血/再灌注后实验组的过氧化脂质明显升高，SOD明显降低，且与对照组之间有显著差异。这表明脑组织缺血缺氧时无氧代谢产生的大量代谢产物，在再灌注恢复血运后，在氧分子的氧化作用下发生超氧化反应，消耗了大量的SOD，故而血中和脑组织内SOD明显降低，过氧化脂质增高。当脑缺血／再灌注发生后，细胞内ATP依次分解为AMP→腺苷→肌苷→次黄嘌呤。由于缺血及能量消耗，次黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶作用下转化为黄嘌呤，进而变为尿酸并产生超氧离子自由基。自由基产生一系列连锁反应使细胞结构破坏。故本组实验中，用电镜观察脑组织的超微结构，发现缺血组神经元显示程度不同的肿胀和退行性变，线粒体和粗面内质网肿胀，线粒体腔扩张，突触小泡聚集等细胞和膜结构受损的表现。显示了缺血再灌注中自由基对脑组织细胞的损伤。本组实验研究中，还观察了脑微循环受损的情况。在电镜下发现，脑的毛细血管有明显受损改变。毛细血管内皮细胞变性，胞浆内空泡。内皮细胞胞核固缩，染色质边集，核膜凹陷。胞浆内细胞器减少，线粒体、粗面内质网（RER）变性。毛细血管基底膜（BM）变得模糊不清。脑微循环障碍、毛细血管内皮细胞变性，又导致功能改变，内皮细胞分泌产生NO的功能障碍，血和脑组织中NO含量降低。这些改变又必然影响脑组织细胞的血液供应，加重脑组织细胞的缺血缺氧。于是在缺氧条件下，能量代谢障碍，引起抗氧化基团形成减少，又可能进一步加重氧自由基在损伤中的作用。
   
　　本组实验中，观察了羌菖注射液对脂质过氧化损伤的保护作用。结果发现治疗组的LPO明显低于缺血／再灌注组；而治疗组的SOD水平明显高于缺血／再灌注组，表明羌菖注射液具有清除超氧化物阴离子自由基、减轻脂质过氧化损伤、保护细胞的作用。羌活具有抗血栓形成的作用［1］，增加脑血流量，改善脑血液循环［２，３］，改善血液流变性作用［4］。有文献报道羌菖合剂可以防治实验性脑缺血之脑损伤［5］；说明羌活、石菖蒲通过对脑微循环的影响，保护脑毛细血管，从而保护缺血／再灌注过程中的脑组织细胞，减轻了缺血及再灌注的损伤作用。

【参考文献】
  　　［１］ 张明发，沈雅琴，朱自平，等． 羌活的镇痛抗炎抗血栓形成作用研究［J］． 中医药研究，1996，(6)：51～52．

　　［2］ 赵鲁鸣，周恩平，王世军，等．脑脉颗粒剂对家犬脑循环及血压影响的研究［J］．中成药，1998，20（4）：32～33．

　　［3］ 冯英菊，谢人明．羌活对麻醉动物脑循环的作用［J］．陕西中医，1998，19（1）：37～38．

　　［4］ 王 涛，杨 奎，王家葵，等 ．羌活的药理作用［J］．中药药理临床,1996，12（4）：12～15．如何快速发表论文

　　［5］ 王天然，曾祥元，朱国标，等．羌菖合剂对结扎右侧颈总动脉大鼠脑损伤作用的初步研究［J］．中国微循环， 2000，4（4）：221～222．